生物学论文2000字:前列腺癌组织中miR-802、RAB23的临床意义

　　摘要 目的 研究前列腺组织中微小RNA（microRNA，miR）-802及RAB23基因的表达及其临床意义。方法 应用荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）及检测80例前列腺癌组织和癌旁组织中miR-802与RAB23的表达，免疫组化检测癌组织及癌旁组织中RAB23蛋白表达情况，统计学分析组间miR-802与RAB23的表达差异及两者与临床病理特征之间的关系。结果 前列腺癌组织中RAB23蛋白明显高于癌旁组织（t=3.775，P=0.000）。癌组织miR-802 mRNA相对表达量明显低于癌旁组织（t=13.716，P=0.000），而癌组织中RAB23 mRNA相对表达量显著高于癌旁前列腺组织（t=21.313，P=0.000）。癌组织中miR-802与RAB23相对表达量呈显著负相关（r=-0.626，P=0.000）。癌组织中miR-802、RAB23表达与Gleason评分、肿瘤TNM分期有关（均P<0.05），而与年龄、初始psa水平、有无远处转移无关（p>0.05）。高miR-802表达组与低miR-802表达组3年总体生存率（OS）无明显差异（c2=3.214，P=0.085）。高RAB23表达组患者3年OS显著低于低RAB23表达组患者（c2=4.861，P=0.022）。结论 前列腺癌组织中miR-802表达下降，而Rab23表达升高，两者均参与前列腺癌的发生发展，有望成为前列腺癌诊断、治疗及评估预后的新的生物学靶点。【生物学论文2000字】

　　关键词 前列腺癌；miR-802；RAB23；临床意义

　　Expression and clinical significance of miR-802 and RAB23 in prostate cancer

　　Abstract Objective To study the expression and clinical significance of microRNA (miR)-802 and RAB23 genes in prostate tissues. Methods Fluorescence real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of miR-802 and RAB23 in 80 prostate cancer tissues and adjacent tissues. Immunohistochemistry was used to detect RAB23 protein expression. The expression of miR-802 and RAB23 between the two groups and their relationship with clinicopathological features were analyzed statistically. Results The RAB23 protein in prostate cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues (t=3.775, P=0.000). The relative expression of miR-802 mRNA in cancer tissues was significantly lower than that in adjacent tissues (t=13.716, P=0.000), while the relative expression of RAB23 mRNA in cancer tissues was significantly higher than that in adjacent prostate tissues (t=21.313, P=0.000). .There was a significant negative correlation between the relative expression of miR-802 and RAB23 in cancer tissues (r=-0.626, P=0.000). The expression of miR-802 and RAB23 in cancer tissues was correlated with Gleason score and tumor TNM stage (P<0.05), but="" not="" with="" initial="" psa="" level="" and="" distant="" metastasis="" p="">0.05). There was no significant difference in 3-year overall survival (OS) between the high miR-802 expression group and the low miR-802 expression group (c2=3.214, P=0.085). The 3-year OS of patients with high RAB23 expression was significantly lower than those of the low RAB23 expression group (c2=4.861, P=0.022). Conclusion The expression of miR-802 is decreased in prostate cancer tissues, and the expression of Rab23 is increased. Both of them are involved in the development of prostate cancer, and they may become a new biological target for the diagnosis, treatment and prognosis of prostate cancer.【生物学论文2000字】

　　Key words Prostate cancer; MiR-802; RAB23; Clinical significance

　　前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一。2015年我国男性前列腺癌的发病率6.03/1万例，死亡率2.66/1万例，严重危害我国老年男性健康[1，2]。早期PCa常无典型的临床症状，晚期时可出现尿路梗阻、骨骼疼痛等症状，对于晚期转移性前列腺癌及去势抵抗前列腺癌，死亡率较高[3]，需要深入研究PCa的病因及发病机制。微小RNA（micro RNA，miR）是真核细胞内一段内源性、非编码、长度约18～25个核苷酸的RNA调控序列，其不具有编码蛋白质功能，但可结合目的基因mRNA的3’非翻译区,，通过改变mRNA的稳定性，影响mRNA翻译等机制，影响肿瘤细胞的增殖、浸润转移和凋亡等生物学行为[4]。前列腺癌组织中存在多种mirna的异常表达的现象，在前列腺癌的发生发展中发挥重要的作用，有可能成为前列腺癌诊断和治疗的靶点[5]。miRNA-802位于染色体21q22.12，在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用，Yuan等人研究发现miR-802在乳腺癌及乳腺癌细胞系中表达降低，当过表达miR-802时可通过抑制FoxM1的表达发挥抗肿瘤作用[6]。RAB23基因位于6p12.1上，该基因编码Ras超家族的小GTP酶，Rab蛋白参与调节与细胞内膜运输相关的多种细胞功能，包括自噬和对细菌感染的免疫应答。该基因表达异常参与肿瘤的发生发展过程，如在前列腺癌组织中存在表达升高的现象，当在瘤细胞的浸润和侵袭能力下降[7]。在胃癌研究中发现，RAB23基因是miR-802生物学靶点，miR-802能够在转录后水平抑制RAB23基因的表达，促进肿瘤的恶性进展[8]。但目前在前列腺癌中的两者的表达及二者之间的关系尚不清楚，有待深入研究。本研究通过检测前列腺癌组织中miR-802和RAB23表达及两者之间的相关性，探讨两者在前列腺癌发生发展中的作用及意义。【生物学论文2000字】

　　1 一般临床资料与方法

　　1.1 一般临床资料

　　选取2015年1月至2016年1月于我院诊治的80例PCa患者的临床病理资料。病例组纳入标准：1）患者均经穿刺活检病理或术后病理检查明确诊断为前列腺腺癌。2）所有患者均为初次诊治，既往未接受过内分泌治疗、放射治疗等抗肿瘤治疗。3）临床病理及随访资料完整，患者及家属均知情同意并已签署知情同意书。排除标准：1）合并前列腺炎、泌尿生殖系感染、呼吸道感染等疾病。2）合并其它器官系统的恶性肿瘤。3）合并严重的心肝肺肾等脏器功能不全。患者年龄42～78岁，平均年龄（55.24±7.1）岁；TNM分期及病理分级参考第八版美国癌症联合会标准[9]：其中Ⅰ~Ⅱ期43例，Ⅲ~Ⅳ期37例；病理分级：高分化及中分化（G1～2）39例，低分化及未分化（G3～4）41例。所有患者自出院之日起开始随访，每1～3个月随访一次，以门诊或电话方式随访，随访时间3～48个月，中位随访时间32个月，收集患者生存数据，计算患者生存时间，随访至患者死亡或随访终止时间，随访截止时间2016年1月。【生物学论文2000字】

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 qRT-PCR检测miR-802、RAB23的表达

　　收集术中新鲜获取的部分癌组织及癌旁组织，置于冻存管内液氮速冻，转运至实验室置于-80℃冰箱保存。取约100mg标本，应用Trizol法提取总RNA（美国罗氏公司），应用miRNA分离试剂盒提取miRNA。分光光度计检测RNA溶液的浓度及纯度，将合格的总RNA置于-80℃冰箱保存待测。以总RNA为模板，用TaqMan miRNA反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA（美国ABI公司）。反应条件：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min。实验步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行。miR-802特异性茎环正向引物序列：5'-GGACCACCGCTCGCTCATCGCTAA-3'，反向引物序列：5'-TCGCGTTACTATATGCCAAGCCCTAG-3'，内参基因U6正向序列:5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'，反向序列: 3'-GTGCAGGGTCCGAGGT-5'；RAB23正向引物序列:5'-GGGGTACCCCAGATGTTTTGGGAGGAAAAC-3'，下游引物序列:5'-GAAGATCTTCATCTAAAATGGCAAAGAGAA-3'，以GAPDH作为内参照，上游引物序列:5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列:5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。总反应体系20μl，包括1μlcDNA，0.125μlTaqDNA聚合酶、1μl上下游引物、1μl20ⅹSYBR Green及1μl浓度为25mmol/LdNTPs，DEPC水补足体系至20μl。荧光定量PCR反应条件为：95℃ 2min，94℃ 变性15s，60℃ 退火20s，72℃延伸10s，40个循环。所有反应均在ABI7900实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。采用相对Ct值方法进行数据分析，目的基因miR-802及RAB23的表达水平相对于内参基因U6的比值为 2-ΔΔCt，计算 miR-802、RAB23的相对定量表达水平，其中 ΔCt = Ct目的基因-Ct内参基因。【生物学论文2000字】

　　1.2.2 免疫组化检测RAB23蛋白表达

　　采用免疫组化染色（SP法）检测癌组织及癌旁组织RAB23蛋白表达。实验步骤：用切片机将石蜡包埋标本切片，厚度5μm，65℃烘箱2h，常规二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，梯度水化后0.01M（pH6.0）柠檬酸缓冲液100℃水浴30min抗原热修复，自然冷却，PBS洗三次，每次5min，避光条件下3%H2O2灭活内源性过氧化物酶2min，PBS清洗三次，加一抗(兔抗人RAB23多克隆抗体，货号ab251794，均购自美国Abcam公司，稀释比例均为1:500)4℃孵育过夜，PBS清洗三次后，二抗(购自中杉金桥生物公司，稀释比例1:500)37℃孵育30min，DAB显色5min后苏木紫复染3min，常规梯度脱水后，树脂封片。RAB23阳性为细胞浆、细胞核内出现棕黄色颗粒。采用Image J图像分析软件对RAB23蛋白表达进行分析，每张切片选取5个视野（×400），检测每张切片的平均光密度、阳性面积率，结果取5个视野的平均值。【生物学论文2000字】

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS22.0统计软件进行计分析。计量资料以

　　±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，计数资料以率表示，组间比较采用卡方检验，相关性分析采用Pearson线性相关分析。Kaplan-Meier生存分析组间表达与预后之间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1癌组织与癌旁组织中RAB23蛋白表达比较

　　前列腺癌组织中RAB23蛋白主要表达于细胞核或细胞质中，见图1a，而癌旁前列腺组织表达较低或无表达，见图1b，平均光密度值分别为0.268±0.062、0.047±0.013，组间具有明显差异（t=3.775，P=0.000）。

　　图1 a前列腺癌组织中RAB23蛋白表达，b癌旁前列腺组织RAB23蛋白表达

　　2.2 癌组织与癌旁组织中miR-802、RAB23 mRNA表达比较

　　前列腺癌组织与癌旁组织 miR-802 mRNA相对表达量分别为1.230±0.246、1.731±0.215，癌组织miR-802 mRNA相对表达量明显低于癌旁组织（t=13.716，P=0.000），RAB23 mRNA相对表达量分别为1.041±0.210、0.467±0.118，癌组织中RAB23 mRNA相对表达量显著高于癌旁前列腺组织（t=21.313，P=0.000）。前列腺癌组织中miR-802与RAB23相对表达量呈显著负相关（r=-0.626，P=0.000）。

　　2.3 癌组织中miR-802、RAB23表达与临床病理特征间的关系

　　前列腺癌组织中miR-802、RAB23表达与Gleason评分、肿瘤TNM分期有关（均P<0.05），与年龄、初始psa水平、有无远处转移无关（p>0.05）。Gleason评分≥7患者癌组织miR-802水平明显低于Gleason评分≤6患者，肿瘤TNM分期Ⅲ~Ⅳ期患者癌组织RAB23表达明显高于分期Ⅰ～Ⅱ期患者。见表1。

　　表1 前列腺癌组织miR-802、RAB23表达与临床病理特征间的关系

　　临床参数NmiR-802t值P值RAB23t值P值

　　年龄（岁）

　　≤65311.201±0.2021.3770.1721.105±0.2371.8160.073

　　＞65491.267±0.2131.013±0.210

　　Gleason评分

　　≤6361.337±0.2484.0820.0000.937±0.1785.9630.000

　　≥7441.121±0.2191.180±0.237

　　初始PSA（ng/ml）

　　≤10241.213±0.1760.6280.5321.082±0.2051.2090.230

　　＞10561.245±0.2211.023±0.198

　　TNM分期

　　Ⅰ～Ⅱ期461.287±0.2182.4530.0160.983±0.1913.1120.003

　　Ⅲ～Ⅳ期341.162±0.2351.131±0.234

　　远处转移

　　有161.217±0.2000.397

0.6921.076±0.2040.7940.430

　　无641.240±0.2091.030±0.208

　　2.4癌组织miR-802、RAB23 mRNA不同表达表达水平与患者预后关系

　　癌组织中miR-802 mRNA相对表达量以中位数（P50）1.226为临界值，分为高表达组38例，低表达组42例，高miR-802表达组3年总体生存率（OS）65.8%（25/38），低miR-802表达组3年OS为50.0%（21/42），Kaplan-Meier分析（log-rank 检验）表明两组患者3年OS无明显差异（c2=3.214，P=0.085）。【生物学论文2000字】

　　RAB23 mRNA相对表达量以中位数（P50）1.045为临界值，分为高表达组44例和低表达组36例。高RAB23表达组3年OS为36.4%（19/44），低RAB23表达组3年OS为75.0%（27/36），Kaplan-Meier分析（log-rank 检验）表明高RAB23表达组患者3年总体生存率显著低于低RAB23表达组患者（c2=4.861，P=0.022），如图2。【生物学论文2000字】

图2 不同RAB23表达组前列腺癌患者3年OS比较

　　3 讨论

　　前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来前列腺癌发病率有逐渐升高的趋势，威胁男性健康。目前前列腺癌的治疗主要根据患者年龄、肿瘤分期、病理分级及预期寿命等因素决定治疗方式，如手术、放疗、内分泌治疗及化疗等[10]，但对于去势抵抗性前列腺癌和转移性前列腺癌患者的长期生存率较低，因此，深入研究其发生发展的分子生物学机制，寻找新的诊断治疗方法对延长患者生存方面具有重要意义[11]。miRNA是短的非编码RNA，参与多细胞生物中基因表达的转录后调节。miRNA由RNA聚合酶II转录，初步转录本被核糖核酸酶III切割，产生约70nt具有颈环结构的前体miRNA（pre-miRNA），在细胞质中被Dicer核糖核酸酶进一步切割，产生成熟miRNA。将成熟的miRNA掺入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，其通过与miRNA的不完全碱基配对识别靶mRNA，导致靶mRNA的翻译抑制或去稳定化。

　　miRNA在许多肿瘤如肝癌、前列腺癌等肿瘤均存在异常表达的现象，参与肿瘤的发生发展的调控，有助于肿瘤的早期诊断、治疗方式选择及预后判断[12]。miR-802基因位于21号染色体，有研究表明在舌鳞癌、肝癌等多种肿瘤中均发现表达下调的现象，导致下游基因如MAP2K4等癌基因表达增加，促进肿瘤的发生发展[13]。本研究中，PCa癌组织中

　　miR-802 mRNA的相对表达量明显低于癌旁正常前列腺组织，表明前列腺癌组织中miR-802表达下调。其表达下调的机制可能与miR-802基因位点21q22.12杂合性缺失有关，也可能与表观遗传学修饰后，如甲基化、乙酰化等，导致基因表达下降有关[14]。本研究中，Ⅲ～Ⅳ期、Gleason评分≥7分组癌组织miR-802相对表达量明显低于Ⅰ～Ⅱ期、Gleason评分≤6分癌组织，表明miR-802表达分别与肿瘤较高的TNM分期、Gleason评分有关。其机制可能与miR-802对靶基因Flotillin-2抑制作用下降，导致Flotillin-2表达增加，促进肿瘤的上皮间质转化，促进肿瘤增殖、凋亡减少，最终导致肿瘤的恶性进展，肿瘤分期分级增高[15]。本研究中进一步分析不同miR-802表达水平患者3年总体生存率的差别，结果高表达组与低表达组患者3年总体生存率无明显差异，表明miR-802并非影响患者预后的关键因素，其它影响因素，如肿瘤分级、PSA水平、患者一般身体状况及治疗方式等因素均与患者预后相关[16]。RAB23位于6p12.1，Rab23通过促进囊泡运输和控制溶酶体内吞发挥重要作用。本研究免疫组化结果表明，Rab23蛋白主要存在于细胞核及细胞质中，癌组织中蛋白表达明显高于癌旁组织，并且在mRNA水平也明显升高。结果表明Rab23除了具有膜运输功能之外，Rab23还可能具有基因表达调控功能。Rab23是hedgehog途径的重要负调节因子，并且通过调节该信号传导途径的特定下游基因的表达[17]。研究表明Rab23在肝细胞、胃癌等肿瘤中表达水平增高，siRNA沉默Rab23表达后显着细胞侵袭和迁移能力下降[18]。本研究中，前列腺癌组织中Rab23 mRNA的相对表达量明显较高，表明前列腺癌组织中Rab23表达上调，并且其表达水平与miR-802表达呈显著负相关，其机制可能与Rab23是miR-802靶基因，miR-802表达下降后Rab23基因表达增加[8]。本研究中, Gleason评分≥7分、Ⅲ～Ⅳ期癌组织Rab23基因表达高于评分≤6、Ⅰ～Ⅱ期组，表明Rab23表达与肿瘤高分期及病理分级有关。其机制可能是Rab23对hedgehog途径的抑制作用减弱，促进肿瘤的局部浸润和远处转移，促进肿瘤的恶性进展，此外，其可直接促进转移相关因子Rac1的表达，促进肿瘤的转移[19]。本研究中高Rab23表达组患者3年OS显著低于低表达祖，表明高Rab23表达与患者的不良预后有关，有可能作为前列腺癌患者不良预后的生物学标志。

　　综上所述，前列腺癌组织中miR-802表达下降，而Rab23表达升高，两者均参与前列腺癌的发生发展，有望成为前列腺癌诊断、治疗及评估预后的新的生物学靶点。对于两者的具体作用途径及机制尚需要进一步研究。【生物学论文2000字】

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